免疫亲和色谱与分子印迹技术(三) 除去非特异性吸附的亲和杂质

(4)免疫亲和色谱柱的免疫再生与储存农药残留免疫亲和色谱柱的再生通常采用一定体积的极性有机溶剂(如甲醇等)洗柱，除去非特异性吸附的亲和杂质，然后再用10～15倍柱体积的色谱术平衡缓冲液冲洗免疫亲和色谱柱。在温和条件下，分印免疫亲和色谱柱可再生使用多次。迹技暂不用使用时，免疫可用含0.02％叠氮化钠或0.01％硫柳汞的亲和平衡缓冲液平衡色谱柱，于4℃冰箱中保存。色谱术

(三)免疫亲和色谱技术在农药残留分析中的分印应用

目前国外已经研究开发了多种农药的免疫亲和色谱技术。Lawrence等(1996)采用免疫亲和色谱反相液相色谱联用检测萝b、迹技玉米、免疫草莓等样品中残留的亲和苯基脲类除草剂，检测灵敏度可达2～5μg／kg，色谱术远低于常规高效液相色谱的分印检测限0.1mg／L。David等(1996)将水果提取液中残留的迹技多菌灵用免疫亲和色谱柱净化浓缩，洗脱液采用高效液相色谱法检测，检测限可达0.1μg／kg。Rejeb等(2001)采用免疫亲和色谱分离富集小麦、玉米、羊尿等样品中残留的咪唑啉酮类除草剂和花生中残留的噻氟菌胺(thifluzamide)，Spinks等(1999)采用免疫亲和色谱分离富集除草剂百草枯，均取得了良好的分离富集和检测效果。

我国农药免疫亲和色谱技术研究不多，刘曙照等在我国率先建立了克百威(2005)、三唑磷(2006)和氯磺隆(2006)免疫亲和色谱高效液相色谱联用(IAC-HPLC)技术，分别用于环境水、稻米和农田土壤中克百威、三唑磷和氯磺隆残留的分离富集、定性检测和定量检测。免疫亲和色谱柱容量达1.58～2.6μg／mL柱体积，对目标分析农药的富集倍数为160～250，回收率为90%～102％，经免疫亲和色谱分离净化的样品中几乎没有干扰高效液相色谱检测的杂质，明显优于固相萃取法的分离纯化与富集效果。

(四)免疫亲和色谱技术需要进一步解决的问题和发展方向

在农药残留分析中，免疫亲和色谱主要作为样品提取液中痕量农药残留的高效分离富集手段，然后与高效液相色谱、气相色谱等方法联用进行检测，深受农药残留分析机构和技术人员的欢迎。

诚然，免疫亲和色谱技术的开发应用中也存在一些局限性：①作为免疫亲和色谱固相基质配体的抗体，其本质是具有生物活性的免疫球蛋白，对有机溶剂、盐浓度、pH、温度等条件的耐受范围有限，在使用过程中容易失去活性，限制了免疫亲和色谱的使用范围和使用寿命；②目前所使用的免疫亲和色谱柱需要有效避免固相基质对非目标分析物的非特异性吸附；③免疫亲和色谱固定相制备需要较多的纯化抗体，面临较高的成本压力；④目前已研究开发的免疫亲和色谱固定相耐压性有限，还难以直接用作高效液相色谱柱进行在线分析。

因此，免疫亲和色谱技术需要进一步解决的问题是：应用现代科学技术，研制能在比较苛刻的条件下保持高免疫活性的抗体；研制无非特异性吸附、耐压性强、理化性能稳定、与配体相容性好的固相基质；优化配体与基质的耦联方法，提高免疫亲和色谱柱容量；研制免疫亲和色谱柱稳定剂，延长色谱柱的使用寿命，增加免疫亲和色谱柱的重复使用次数，降低使用成本；使免疫亲和色谱从单纯的样品前处理向在线分析方向发展；将多种抗体或簇特异性抗体固定于固相基质，制备多配体或簇特异性免疫亲和色谱柱，对多种目标分析组分同时进行分离富集，使单组分免疫亲和色谱技术向多组分免疫亲和色谱技术发展。

二、分子印迹技术

(一)分子印迹技术原理

分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)是以在空间结构和结合位点上与目标分析物相匹配、对目标分析物具有选择性可逆结合能力的高分子聚合物为受体(也被称为人工合成抗体)的分离分析技术。

建立农药分子印迹技术的基础是制备对目标分析农药具有选择性可逆结合能力的分子印迹聚合物。以目标分析农药分子为模版，设计、合成或选择与目标分析农药在分子结构、分子问作用力等方面相匹配的功能单体[如甲基丙烯酸(methylacrylic acid，MAA)、4-MAA)、乙烯基安息香酸等]，将功能单体与模版分子在适当溶剂中结合形成复合物(如甲基丙烯酸与氯三嗪、4-乙烯基吡啶与2，4-滴、4-乙烯基吡啶与吲哚乙酸、三氟甲基丙烯酸与甲磺隆、乙烯基安息香酸与有机磷农药的复合物等)，然后选择适当的交联剂[如二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA)、季戊四醇三丙烯酸酯等]，在适当引发剂[如偶氮二异丁腈(azobisisobtltylnitrile，AIBN)等]引发下将功能单体相互交联起来，使功能单体与模板分子相匹配的功能基团和空间结构得以固定，形成稳定的分子印迹聚合物。最后采用强极性溶剂多次萃取、索氏提取器反复回流萃取等方法，将聚合物中的模板分子脱除，这样就在聚合物上留下了和模板分子在空间结构和结合位点相匹配的三维空穴，这样的空穴能够重新选择性地与模板分子结合。

(二)分子印迹技术的应用现状和特点

目前，分子印迹技术在农药残留分析中主要用于复杂样品中目标分析农药的分离、富集与净化。用针对目标分析农药的分子印迹聚合物制备固相萃取柱，将提取液过柱，样品中的目标分析农药被选择性地保留在聚合物的空穴中，然后用少量洗脱剂洗脱目标分析农药，达到选择性分离、富集和净化的目的。从柱中洗脱的目标分析农药可采用不同方法进行检测，实现对复杂样品中痕量目标分析农药的高灵敏度分析。也有少量应用分子印迹聚合物聚合物柱进行在线色谱分离分析的报道。

分子印迹聚合物是人工合成的，具有一定的选择性识别能力和与高分子物质同样的抗腐蚀、耐高温、耐有机溶剂等优点，因而可应用于生物工程、临床医学、环境监测、食品工业等众多领域，克服了天然抗体的局限性，在农药残留分析、特别是脂溶性农药残留分析中具有明显的优势。已报道的农药分子印迹技术研究主要集中于三嗪类除草剂，其他还有2，4-滴、甲磺隆、吲哚乙酸和少数有机磷杀虫剂。

分子印迹技术目前存在的主要问题是，现有分子印迹聚合物的三维空穴与模板分子在空间结构和结合位点的契合上还远达不到抗原抗体结合的精密程度。因此分子印迹聚合物对目标分析物的识别能力还远达不到抗体对抗原的特异性识别水平。分子印迹聚合物对非目标分析物的非特异性吸附也是困扰分子印迹技术应用的主要问题之一。

分子印迹技术的核心是分子印迹聚合物的制备。设计研制能够与模板分子精密匹配的功能单体、研究制备自身不产生非特异性吸附的高效交联剂、优化分子印迹聚合物制备技术、消除分子印迹聚合物的非特异性吸附是解决分子印迹技术现存问题的关键。

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相关链接：苯基脲类，咪唑啉酮类，吲哚乙酸，甲磺隆